نویسندگان: آلیس چی‌ین، دیوید بی. ادگار، جان ام. ترلا

وابستگی: دانشکده علوم زیستی، دانشگاه سینسینتی، اوهایو

تاریخ دریافت: 12 آوریل 1976

یک آنزیم پایدار DNA پلیمراز (EC 2.7.7.7) با دمای بهینه‌ی عملکرد 80 °C از ترموفیل فوق‌گرما دوست Thermus aquaticus خالص‌سازی شده است. این آنزیم فاقد فعالیت‌های فسفومونو‌استراز، فسفودی‌استراز و اگزونوکلئاز تک‌رشته‌ای می‌باشد.

بیشترین فعالیت آنزیم نیازمند حضور هر چهار دئوکسی‌ریبونوکلئوتید و DNA فعال‌شده‌ی تیموس گوساله است. نیاز مطلق آنزیم به کوفاکتور کاتیون دوظرفیتی توسط Mg²⁺ تأمین می‌شود و تا حد کمتری توسط Mn²⁺.

کاتیون‌های یک‌ظرفیتی تا غلظت 0.1M اثر مهاری قابل توجهی نشان ندادند. بهترین pH برای فعالیت 8.0 در بافر تریس(hydroxymethyl)آمینومتان–هیدروکلرید است.

وزن مولکولی آنزیم با سانتریفیوژ گرادیان ساکاروز و ژل فیلتراسیون بر روی Sephadex G-100 حدود 63,000 تا 68,000 دالتون برآورد شد. نیاز به دمای بالا، اندازه کوچک و فقدان فعالیت نوکلئازی، این پلی‌مراز را از پلی‌مرازهای E. coli متمایز می‌سازد.

در دو دهه اخیر، پژوهش‌ها روی سنتز DNA در E. coli شناخت ما از این فرایند بنیادی را گسترش داده‌اند. آنزیم DNA پلیمراز I ابتدا به عنوان عامل اصلی سنتز DNA شناخته می‌شد و توسط آرتور کورنبرگ و همکارانش خالص‌سازی و بررسی شد. این مطالعات شامل ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی، نیاز به DNA آغازگر-قالب، محصول نهایی و مکانیزم پلیمریزاسیون بودند.

در سال ۱۹۶۹، موتانت PolA کشف شد که فاقد فعالیت DNA پلیمراز I بود ولی سنتز DNA را به‌طور طبیعی انجام می‌داد. این یافته تردیدهایی درباره نقش واقعی پلیمراز I ایجاد کرد و باعث شناسایی دو پلیمراز جدید شد.

برخلاف بررسی‌های گسترده در باکتری‌های مزوفیل، مطالعات کمی روی پلیمرازهای DNA ترموفیل انجام شده است. ترموفیل‌ها در دماهای بالای ۴۵ درجه سانتی‌گراد زندگی می‌کنند و پژوهش درباره آن‌ها، به‌ویژه ساختار پروتئین‌ها، در ۲۵ سال اخیر اهمیت زیادی یافته است. این مقاله به معرفی و مقایسه یک پلیمراز ترموفیل با نمونه‌های مزوفیل اختصاص دارد.

باکتری Thermus aquaticus سویه YT‑1 که توسط Paul Ray از شرکت Burroughs Wellcome تأمین شد.

محیط معدنی تعریف‌شده شامل 0.3٪ اسید گلوتامیک به‌عنوان منبع کربن و نیتروژن، همراه با بیوتین، تیامین (0.1 mg/L) و نیکوتینیک اسید (0.05 mg/L). ترکیب نمک‌ها شامل CaSO₄·2H₂O، MgSO₄·7H₂O، NaCl، نیترات‌ها، ZnSO₄، H₃BO₃، CuSO₄، NaMoO₄·2H₂O، CoCl₂، FeCl₃، MnSO₄·H₂O و Na₂HPO₄ بود. pH محیط با NaOH روی 8.0 تنظیم شد.

ابتدا در ارلن‌های 500 میلی‌لیتری در دمای 75°C و شیکر آبی رشد داده شدند. پس از رسیدن به 170 واحد Klett، یک لیتر کشت به کاربوی‌های 16 لیتری منتقل و با هوادهی استریل در دمای ثابت 75°C به مدت 20 ساعت ادامه یافت. سلول‌ها با سانتریفیوژ جریان پیوسته جمع‌آوری شدند.

سلول‌ها در بافر KP (فسفات پتاسیم، گلیسرول، EDTA، سدیم آزید و KCl) معلق و با دستگاه اولتراسونیک Branson شکسته شدند. سوپرنات پس از سانتریفیوژ به‌عنوان عصاره خام استفاده شد.

اندازه‌گیری غلظت پروتئین با روش Lowry انجام شد.

• DNA پلیمراز: مخلوط واکنش 125 μL با بافر Tris‑HCl، MgCl₂، KCl، چهار نوکلئوتید دئوکسی، و DNA تیموس گوساله فعال‌شده؛ انکوباسیون 30 دقیقه در 80°C.
• اگزونوکلئاز: استفاده از DNA نشاندارشده با تریتیوم و سنجش نوکلئوتیدهای محلول در اسید.
• فسفاتاز قلیایی و فسفودی‌استراز: زیرلایه‌های p‑نیتروفنیل و مشتقات تیمیدین مونوفسفات.

الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید 7٪، سانتریفیوژ گرادیان ساکارز، ژل فیلتراسیون با استانداردهای پروتئینی و کروماتوگرافی بر روی ستون‌های DEAE‑Sephadex، فسفوسلولز و DNA‑سلولز در دمای اتاق انجام شد.

DNA تیموس گوساله، چهار نوکلئوتید دئوکسی، RNase، DNase، لیزوزیم، آلبومین تخم‌مرغ، و رادیوایزوتوپ‌های [³H]dTTP، [³H]dATP و [³H]تیمین از منابع معتبر تهیه شدند.

در ابتدا عصاره خام از کشت ۱۶ لیتری سلول تهیه شد و پس از تیمار اولتراسونیک روی ستون DEAE‑سفادکس قرار گرفت. آنزیم با شیب غلظتی KCl جدا شد و در حدود غلظت ۰.۱۵ مولار الویت گردید. نمونه به‌صورت دیالیز‌شده به ستون فسفوسلولز منتقل شد که دوباره اوج فعالیت آنزیم در همین غلظت نمک مشاهده شد.

پس از دیالیز دوم، بافری شامل تریس، β‑مرکاپتو‌اتانول، گلیسرول و EDTA برای پایداری آنزیم افزوده شد. همچنین BSA نیز اضافه شد، زیرا حذف آن باعث از بین رفتن فعالیت آنزیم می‌شد.

در مرحله نهایی، نمونه روی ستون DNA‑سلولز بارگذاری و با بافر حاوی BSA شستشو داده شد. بیشترین فعالیت در غلظت ۰.۶ مولار NaCl الویت شد. این نمونه‌ها برای آنالیزهای بعدی نگه‌داری شدند.

به دلیل وجود BSA، امکان اندازه‌گیری خلوص بر اساس فعالیت ویژه وجود نداشت؛ بنابراین الکتروفورز ژل پلی‌اکریلامید برای برآورد خلوص استفاده شد. برخی باندها مربوط به BSA و برخی احتمالاً مربوط به آنزیم یا آلودگی‌های پروتئینی بودند.

برای بررسی فعالیت‌های جانبی ناخواسته، آزمون‌هایی برای سنجش فسفاتازها، فسفودی‌استرازها و اگزونوکلئازها انجام شد. نتیجه نشان داد که تمام این فعالیت‌ها در حد زمینه و بسیار ناچیز هستند. هیچ فعالیت قابل توجه اگزونوکلئازی، چه در حضور و چه در غیاب ATP، مشاهده نشد.

• دمای بهینه: فعالیت بیشینه در ۸۰ درجه سلسیوس؛ حدود ۱۰ تا ۱۵ برابر بیشتر از ۳۷ درجه.
• pH بهینه: محدوده ۷ تا ۸؛ بیشترین فعالیت با بافر تریس‑کلرید pH 7.8.
• نیاز به یون‌های دوظرفیتی: Mg²⁺ با غلظت ۱۰ میلی‌مولار بهترین عملکرد را داشت؛ Mn²⁺ تا حدی مؤثر و Ca²⁺ بی‌اثر بود.
• اثر یون‌های تک‌ظرفیتی: NaCl (۴۰ mM) و KCl (۶۰ mM) باعث افزایش فعالیت؛ غلظت‌های بالای ۱۰۰ mM بازدارنده.
• نیازهای واکنش: حذف DNA قالب، Mg²⁺ یا dNTP باعث افت شدید فعالیت آنزیم می‌شود.

• سانتریفیوژ گرادیان ساکارز: وزن تقریبی حدود ۶۸ کیلو دالتون (نزدیک به BSA).
• ژل فیلتراسیون: وزن مولکولی حدود ۶۳ کیلو دالتون.

یک DNA پلیمراز پایدار و ترموفیل از Thermus aquaticus خالص‌سازی شد. داده‌های ژل نشان می‌دهد که نمونه نهایی کاملاً خالص نیست اما اکثراً آنزیم همراه با پروتئین BSA وجود دارد. تلاش برای حذف BSA فقط بخشی موفق بود و با کاهش شدید فعالیت روبرو شد؛ احتمالاً به علت افت غلظت پروتئین آنزیم در غیاب BSA.

وزن مولکولی آنزیم با سانتریفیوژ گرادیان ساکارز حدود ۶۸ کیلو دالتون و با ژل فیلتراسیون حدود ۶۳ کیلو دالتون به‌دست آمد که هر دو مقدار نزدیک به هم هستند. این آنزیم نسبت به سه پلیمراز شناخته‌شده E. coli کوچک‌تر است؛ اگرچه نوعی پلیمراز از Bacillus subtilis با وزن مولکولی کمتر (حدود ۴۶ kDa) وجود دارد.

در E. coli، پلیمراز I توسط تریپسین به دو بخش تقسیم می‌شود: بخش بزرگ‌تر (۷۶ kDa) با حفظ قابلیت سنتز DNA و فعالیت اگزونوکلئاز ۳′→۵′؛ بخش کوچک‌تر (۳۴ kDa) مسئول اگزونوکلئاز ۵′→۳′ است. هنوز معلوم نیست پلیمراز T. aquaticus نیز به صورت طبیعی چنین تقسیم‌بندی‌ای داشته باشد یا در فرآیند خالص‌سازی این اتفاق افتاده باشد.

در نمونه نهایی هیچ فعالیت مهم اگزونوکلئاز تک‌رشته‌ای دیده نشد. همچون پلیمرازهای مزوفیل، برای فعالیت مطلوب نیاز به چهار dNTP، DNA و Mg²⁺ دارد. حذف هر یک از نوکلئوتیدها همچنان تا ۳۵٪ از فعالیت باقی می‌ماند که بالاتر از اکثر پلیمرازهای باکتریایی و مشابه بعضی پلیمرازهای پستانداران است؛ احتمالا به دلیل افزوده شدن چند dTTP به انتهای مکمل.

مهم‌ترین ویژگی آنزیم دمای بهینه بسیار بالا (۸۰°C) است که حدود ۱۵ درجه بالاتر از پلیمراز Bacillus stearothermophilus می‌باشد. این ویژگی باعث کاربرد بسیار مناسب آن در محیط‌های دمای بالا می‌شود و حتی برای سنتز DNA از قالب RNA (عملکرد مشابه ریورس ترنسکریپتاز) می‌تواند مفید باشد. در حالی‌که بسیاری پلیمرازهای دیگر (مثل E. coli) توان سنتز روی RNA دارند اما غالباً محصول ناقص تولید می‌کنند که به علت موانع ساختاری RNA است.

با وجود این آنزیم که در دمای بالا فعال می‌ماند، می‌توان ساختارهای RNA را با حرارت بالا “ذوب” کرد و مانع سنتز را کاهش داد. پژوهشگران در حال بررسی کاربرد استفاده از RNAهای خالص به عنوان قالب برای این آنزیم هستند.