توضیحات
معرفی و مکانیسم عملکرد
ویروس هپاتیت C (HCV) از پاتوژن‌های مهم منتقله از راه خون است که به دلیل تنوع ژنتیکی بالا و لود ویروسی متغیر، نیازمند متدهای مولکولی بسیار حساس برای تشخیص اولیه و پایش است. کیت STRP™ سیناکلون با ترکیب دو مرحله سنتز برگشتی (RT) و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای (Nested PCR)، تکثیر قطعه هدف از ژنوم HCV را با بالاترین دقت امکان‌پذیر می‌سازد. این سامانه با استفاده از پرایمرهای اختصاصی دو مرحله‌ای، خطاهای ناشی از باندهای غیراختصاصی را به صفر نزدیک می‌کند.
ویژگی‌ها و مزایای برجسته
- پکیج تشخیصی جامع: وجود محلول RNX-Plus در کیت، نیاز به تهیه جداگانه کیت استخراج RNA را برطرف می‌سازد.
- عدم نیاز به لودینگ بافر: محصولات نهایی PCR قابلیت لود مستقیم بر روی ژل آگارز ۲ درصد را دارند.
- کاهش آلودگی متقاطع: استفاده از پروتکل محافظت‌شده و مینرال اویل برای تثبیت حجم و جلوگیری از تبخیر حین چرخه‌های حرارتی.
کاربردهای آزمایشگاهی
- آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و پاتولوژی جهت غربالگری و تایید مولکولی عفونت HCV.
- مراکز تحقیقاتی ویروس‌شناسی و مطالعات اپیدمیولوژی بیماری‌های عفونی و کبدی.
شرایط نگهداری و انبارداری
- دمای نگهداری کلیه اجزای کیت: 20°C-.
- شرایط حمل و نقل: زنجیره سرد بر روی یخ (Wet Ice).
- به منظور حفظ پایداری آنزیم‌های حساس (RT و Taq)، از تکرار چرخه‌های انجماد و ذوب (Freeze-Thaw) خودداری شود.
- نمونه‌های RNA استخراج‌شده باید ظرف مدت حداکثر ۳ ساعت مصرف شوند یا در دمای -70 °C منجمد گردند.
محتویات کیت
- محلول استخراج RNX-Plus (مقدار 25mL)
- مخلوط واکنش دور اول (HCV PCR Mix I) (مقدار 1700µL)
- مخلوط واکنش دور دوم (HCV PCR Mix II) (مقدار 1100µL)
- آنزیم رونوشت‌بردار معکوس (RT Enzyme) (مقدار 50µL)
- آنزیم Taq DNA Polymerase (مقدار 25µL)
- کنترل مثبت (Positive DNA Control) (مقدار 100µL)
- آب فاقد نوکلئاز تیمار شده با DEPC (مقدار 2x1mL)
- روغن معدنی (Mineral Oil) (مقدار 3mL)
(مواد مورد نیاز که باید توسط آزمایشگاه تامین شوند: کلروفرم، ایزوپروپانول و اتانول ۷۰ درصد)
جدول مشخصات فنی
| مشخصه | مقدار / توضیح |
|---|---|
| نام محصول | STRP™ Hepatitis C Virus Detection Kit |
| کمپانی سازنده | سیناکلون (SinaClon BioScience) |
| شماره کاتالوگ (REF) | PK3041 |
| روش سنجش | Single-tube RT + Nested PCR |
| نوع نمونه | سرم و پلاسمای انسانی |
| طول قطعه تکثیری نهایی | 234bp |
| دمای نگهداری کیت | 20°C- |
| شرایط حمل | زنجیره سرد (Wet Ice) |
| ظرفیت بسته‌بندی | 50 تست |
راهنمای استفاده
مرحله اول: استخراج RNA (با محلول RNX-Plus)
- مقدار 50µL از سرم یا پلاسما را به 450µL محلول سرد RNX اضافه کرده، ورتکس نمایید و ۱۰ دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
- مقدار 100µL کلروفرم اضافه کرده، ۳ تا ۵ ثانیه ورتکس کنید و در دور 12,000rpm به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ نمایید.
- فاز شفاف بالایی را به تیوب جدید منتقل کرده و به همان نسبت (250 تا 300µL) ایزوپروپانول اضافه کنید. ۱۰ بار اینورت کرده، حداقل ۲۰ دقیقه در دمای 20°C- قرار دهید و سپس ۱۵ دقیقه در 12,000rpm سانتریفیوژ کنید.
- مایع رویی را تخلیه کرده، به رسوب حاصل 200µL اتانول ۷۰ درصد بیفزایید، ۱۰ بار اینورت کرده و ۵ دقیقه در 12,000rpm سانتریفیوژ کنید.
- مایع رویی را دور ریخته و اجازه دهید پلت RNA به مدت ۲۰ الی ۳۰ دقیقه در دمای اتاق به صورت نیمه‌کامل خشک شود.
- پلت را در 30µL آب DEPC حل نمایید.
مرحله دوم: سنتز cDNA و دور اول PCR (First Round)
- به ازای هر واکنش، مخلوط زیر را روی یخ در تیوب PCR تهیه کنید:
- مخلوط HCV PCR Mix I (مقدار 33.7µL)
- آنزیم RT Enzyme (مقدار 1µL)
- آنزیم Taq DNA Polymerase (مقدار 0.3µL)
- روغن Mineral Oil (مقدار 40µL)
- قبل از افزودن الگو، تیوب RNA را ۱ دقیقه در دمای 95°C انکوبه کرده و سریعاً روی یخ بگذارید.
- مقدار 10µL از RNA استخراج‌شده (یا کنترل مثبت/آب DEPC برای کنترل‌ها) را اضافه کنید (حجم نهایی 45µL).
- برنامه ترموسایکلر دور اول:
- یک چرخه سنتز cDNA: دمای 42 °C به مدت 20 دقیقه | دمای 93 °C به مدت 2 دقیقه
- ۲۰ چرخه تکثیر: دمای 93 °C به مدت 30 ثانیه | دمای 55 °C به مدت 40 ثانیه | دمای 72 °C به مدت 30 ثانیه
مرحله سوم: دور دوم PCR (Second Round / Nested)
- در تیوب جدید، مخلوط زیر را آماده کنید:
- مخلوط HCV PCR Mix II (مقدار 21.8µL)
- آنزیم Taq DNA Polymerase (مقدار 0.2µL)
- روغن Mineral Oil (مقدار 20µL)
- مقدار 3µL از محصول دور اول PCR را به تیوب بیفزایید (حجم نهایی 25µL).
- برنامه ترموسایکلر دور دوم:
- یک چرخه اولیه: دمای 93°C به مدت 60 ثانیه
- ۳۰ چرخه تکثیر: دمای 93 °C به مدت 30 ثانیه | دمای 55 °C به مدت 35 ثانیه | دمای 72 °C به مدت 30 ثانیه
مرحله چهارم: آنالیز ژل
- مقدار 10µL از محصول نهایی را مستقیماً روی ژل آگارز ۲ درصد لود کنید. مشاهده باند در اندازه 234bp نشان‌دهنده نتیجه مثبت است.
سوالات متداول
۱. اندازه باند اختصاصی در نتیجه مثبت چند جفت‌باز است؟
در نمونه‌های مثبت، پس از الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۲ درصد، باند مشخص در اندازه 234bp مشاهده می‌شود.
۲. در صورت مشاهده حالت اسمیر (Smear) بدون باند مشخص چه اقدامی باید کرد؟
در صورت ایجاد اسمیر بر روی ژل، آزمایش را مجدداً با رقت یک‌دوم (1/2 dilution) از نمونه RNA استخراج‌شده تکرار نمایید.
۳. آیا امکان استفاده از حجم بالاتری از سرم یا پلاسما برای استخراج وجود دارد؟
بله، در صورت نیاز به حساسیت بالاتر می‌توان از 100µL سرم یا پلاسما استفاده کرد؛ در این حالت باید حجم معرف‌های مراحل یک و دو استخراج متناسب با آن افزایش یابد، اما حجم نهایی انحلال پلت در آب DEPC همان 30µL باقی می‌ماند.
برای دانلود کاتالوگ محصول Hepatitis C Virus Detection Kit، روی دکمه زیر کلیک کنید:
نقد و بررسی‌ها
هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.