کیت تشخیص هرپس سیمپلکس (HSV)

معرفی و مکانیسم عملکرد

ویروس‌های هرپس سیمپلکس نوع ۱ و ۲ (HSV-1 و HSV-2) از مهم‌ترین عوامل عفونت‌های تاولی مخاطی، چشمی و دستگاه تناسلی در انسان به شمار می‌روند. به دلیل اهمیت بالینی تمایز و تشخیص زودهنگام این پاتوژن‌ها، روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) به عنوان یکی از دقیق‌ترین متدهای تاییدی شناخته می‌شود. کیت تشخیصی سیناکلون با بهره‌گیری از پرایمرهای بهینه‌سازی‌شده و مسترمیکس با کیفیت، امکان تکثیر دقیق ناحیه هدف از ژنوم ویروس را در نمونه‌های بالینی با حساسیت تحلیلی بالا فراهم می‌آورد.

ویژگی‌ها و مزایای برجسته

• فرمولاسیون Ready-to-use: مسترمیکس کیت حاوی بافر PCR، کلرید منیزیم، dNTPs، پرایمرها و آنزیم لازم است که خطای کاربری را به حداقل می‌رساند.
• تایید کیفی مطمئن: وجود کنترل مثبت اختصاصی به منظور اطمینان از صحت انجام واکنش تکثیر.
• پروتکل سریع و بهینه: چرخه‌های دمایی زمان‌بندی‌شده برای رسیدن به باند شفاف در الکتروفورز ژل آگارز.

کاربردهای آزمایشگاهی

• آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و پاتولوژی جهت تایید مولکولی عفونت‌های ویروسی هرپس.
• مراکز تحقیقاتی و پژوهشی فعال در حوزه بیماری‌های عفونی و ویروس‌شناسی بالینی.

شرایط نگهداری و انبارداری

• دمای نگهداری کلیه اجزای کیت: -20 °C.
• شرایط حمل و نقل: زنجیره سرد بر روی یخ معمولی یا یخ خشک (Wet/Dry Ice).
• به منظور حفظ کیفیت مسترمیکس، از تکرار مکرر چرخه‌های انجماد و ذوب (Freeze-Thaw) خودداری شود.

محتویات کیت (سایز ۲۰ تستی)

• مسترمیکس اختصاصی (HSV Master Mix) (مقدار 400µL)
• کنترل مثبت دی‌ان‌ای (Positive DNA Control) (مقدار 25µL)
• آب دیونیزه عاری از نوکلئاز (DNase Free Deionized Water) (مقدار 1mL)

جدول مشخصات فنی

 راهنمای استفاده 

مرحله اول: استخراج دی‌ان‌ای (DNA Extraction)

• برای جداسازی و خالص‌سازی ژنوم ویروسی می‌توان از کیت‌های استخراج سیناکلون مانند SinaClon Viral Extraction Kit (کد EX6065) یا DNP Kit (کد EX6071) و یا سایر روش‌های استاندارد مانند فنل-کلروفرم استفاده نمود.

مرحله دوم: آماده‌سازی واکنش PCR

1. کیت را از فریزر خارج کرده و اجازه دهید بر روی یخ ذوب شود.
2. تیوب‌های PCR را با نام‌های نمونه بیمار (Test)، کنترل مثبت (Positive Control) و کنترل منفی (Negative Control) نشانه‌گذاری کنید.
3. مقدار 20µL از HSV Master Mix را به هر تیوب اضافه نمایید (پیش از مصرف، مسترمیکس را به‌خوبی مخلوط و اسپین کوتاه کنید).
4. درب تیوب‌ها را بسته و آن‌ها را درون کیسه زیپ‌کیپ محکم به اتاق یا بخش استخراج منتقل کنید.
5. به تیوب نمونه بیمار مقدار 5µL از دی‌ان‌ای استخراج‌شده اضافه کنید. به تیوب کنترل مثبت مقدار 5µL از Positive DNA Control و به تیوب کنترل منفی مقدار 5µL آب عاری از DNase اضافه نمایید (حجم نهایی واکنش 25µL خواهد بود).
6. درب میکروتیوب‌ها را بسته، به مدت ۳ تا ۵ ثانیه اسپین کوتاه نمایید و درون دستگاه ترموسایکلر قرار دهید.

مرحله سوم: برنامه دمایی ترموسایکلر (Cycling Parameters)

• واکنش اولیه (1 چرخه): دمای 94 °C به مدت 300 ثانیه
• چرخه‌های تکثیر (33 چرخه):
  
  • دناتوراسیون: دمای 94 °C به مدت 30 ثانیه
  • اتصال: دمای 62 °C به مدت 15 ثانیه
  • گسترش: دمای 72 °C به مدت 40 ثانیه
• گسترش نهایی (1 چرخه): دمای 72 °C به مدت 300 ثانیه

مرحله چهارم: آنالیز و تفسیر نتایج

• مقدار 10µL از محصول PCR را مستقیماً و بدون نیاز به افزودن لودینگ بافر، بر روی ژل آگارز ۲ درصد لود کنید.
• مشاهده باند اختصاصی در اندازه 256bp نشان‌دهنده نتیجه مثبت نمونه از نظر حضور ویروس HSV است.
• برای مقایسه دقیق اندازه باند، استفاده از نشانگر وزنی 100bp DNA Ladder (کد کاتالوگ SL7031) توصیه می‌شود.

سوالات متداول

۱. باند شناسایی‌شده برای نمونه‌های مثبت در چه اندازه‌ای ظاهر می‌شود؟

در نمونه‌های حاوی ویروس، پس از انجام الکتروفورز روی ژل آگارز ۲ درصد، باند شفافی با طول قطعه 256bp ظاهر می‌گردد.

۲. آیا برای انجام واکنش نیاز به تهیه جداگانه آنزیم تگ پلیمراز است؟

خیر، مسترمیکس موجود در این کیت به شکل آماده مصرف فرموله شده و حاوی آنزیم، بافر، نوکلئوتیدها و پرایمرهای تشخیصی مورد نیاز است.

۳. آیا امکان تفکیک نوع ۱ از نوع ۲ با این کیت وجود دارد؟

این کیت به عنوان یک تست کیفی جهت شناسایی حضور ویروس هرپس سیمپلکس (HSV I و HSV II) طراحی شده است و تکثیر قطعه اختصاصی 256bp حضور ژنوم این ویروس‌ها را در نمونه تایید می‌کند.