کیت تشخیص توکسوپلاسما (Toxoplasma)

معرفی و مکانیسم عملکرد

انگل توکسوپلاسما گوندی (Toxoplasma gondii) یک تک‌یاخته انگل اجباری درون‌سلولی از شاخه آپی‌کمپلکسا (Apicomplexa) است که عامل بیماری مشترک و مهم توکسوپلاسموز در انسان و حیوانات به‌شمار می‌رود. این انگل به ویژه در دوران بارداری (با خطر سقط جنین و ناهنجاری‌های مادرزادی عصبی و چشمی) و همچنین در افراد دارای نقص ایمنی (مانند بیماران پیوندی و مبتلایان به نقص سیستم ایمنی) می‌تواند پیامدهای بالینی بسیار خطرناکی ایجاد کند. روش‌های سنتی سرولوژی به دلیل وجود دوره پنجره (Window Period)، پاسخ‌های ایمنی ضعیف در افراد دارای نقص ایمنی یا عدم تمایز عفونت حاد از مزمن، با محدودیت‌هایی همراه هستند. از این رو، شناسایی مستقیم ژنوم انگل از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) به عنوان قطعی‌ترین و حساس‌ترین روش تشخیصی شناخته می‌شود.

کیت تشخیص PCR توکسوپلاسما شرکت سیناکلون بر مبنای تکثیر آنزیمی قطعه‌ای بسیار اختصاصی به طول 115 جفت‌باز (115 bp) از توالی تکراری ژن B1 انگل استوار است. ژن B1 به دلیل دارا بودن کپی‌های متعدد (حدود ۳۵ کپی) در طول ژنوم توکسوپلاسما گوندی، حساس‌ترین شناساگر ژنتیکی این میکروارگانیسم محسوب می‌شود. پرایمرهای بهینه‌سازی‌شده در این کیت، تنها با ژنوم این انگل متصل شده و حتی در حضور مقادیر اندک الگو (تا ۴۵ کپی)، تکثیر ژنتیکی پایدار و اختصاصی را ممکن می‌سازند؛ این امر امکان بروز نتایج مثبت یا منفی کاذب ناشی از اتصال متقاطع به ژنوم میزبان یا سایر تک‌یاخته‌ها را از بین می‌برد.

ویژگی‌ها و مزایای برجسته کیت

• پایداری و بهینه‌سازی اجزا: مسترمیکس کیت حاوی غلظت‌های تنظیم‌شده از بافر واکنش، املاح MgCl2، مخلوط dNTPs و پرایمرهای اختصاصی است که تکرارپذیری بالای نتایج را تضمین می‌کند.
• آنزیم Taq مجزا: تفکیک آنزیم Taq DNA Polymerase از مسترمیکس، امکان کنترل حداکثری پایداری کیت را در طول دوره‌های مصرف فراهم می‌آورد.
• تنوع نمونه‌های بالینی و محیطی: امکان استفاده بر روی انواع نمونه‌های استخراج‌شده از خون، بافت، مایع آمنیوتیک، مدفوع و نمونه‌های محیطی (خاک).
• سهولت در آنالیز نهایی: بارگذاری مستقیم ۱۰ میکرولیتر از محصول واکنش بر روی ژل آگارز، بدون نیاز به بافر بارگذاری (Loading Buffer) مجزا.

کاربردهای تشخیصی و پژوهشی

• شناسایی مولکولی و تایید تشخیصی عفونت‌های حاد و مادرزادی توکسوپلاسموز در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و مولکولی.
• بررسی ژنوم انگل در نمونه‌های بافتی، بیوپسی و سوسپانسیون‌های سلولی در مراکز تحقیقاتی و دانشگاهی.
• غربالگری نمونه‌های دامی، سرمی و دامپزشکی به منظور کنترل سلامت دام و جلوگیری از زنجیره انتقال بیماری مشترک.
• مطالعات اپیدمیولوژی و پایش محیطی وجود انگل در نمونه‌های خاک و فضولات گربه‌سانان.

شرایط نگهداری و انبارداری

• دمای نگهداری کلیه اجزای کیت: -20 °C (فریزر آزمایشگاهی).
• شرایط حمل و نقل: زنجیره سرد بر روی یخ مرطوب (Wet Ice).
• به منظور حفظ عملکرد مطلوب کیت، از قرارگیری طولانی‌مدت محلول‌ها در دمای اتاق و چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب (Freeze-Thaw) خودداری شود. پیشنهاد می‌شود کار با اجزا همواره بر روی یخ انجام گیرد.

محتویات کیت (بسته‌بندی ۵۰ تستی)

• مسترمیکس آماده واکنش (Master Mix): حجم 1000µL (شامل بافر اختصاصی، MgCl2، dNTPs و پرایمرها)
• آنزیم پلیمراز (Taq DNA Polymerase): حجم 10µL
• کنترل مثبت دی‌ان‌ای (Positive DNA Control): حجم 100µL
• آب دیونیزه عاری از نوکلئاز (DNase Free Deionized Water): حجم 1000µL

جدول مشخصات فنی 

راهنمای استفاده و پروتکل آزمایشگاهی

تجهیزات و ملزومات مورد نیاز

• کیت استخراج دی‌ان‌ای (مانند کیت‌های SinaPure با کد EX6011 یا DNP با کد EX6071 سیناکلون برای نمونه‌های بافتی/انسانی، یا کیت‌های تخصصی استخراج از خاک و مدفوع)
• دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler)
• سانتریفیوژ میکروتیوب (میکروفیوژ آزمایشگاهی)
• سمپلرهای دقیق به همراه سرسمپلرهای فیلتردار و عاری از نوکلئاز
• تجهیزات کامل ژل الکتروفورز و ترانس‌ایلومیناتور UV
• مارکر مولکولی 50bp DNA Ladder (کد کاتالوگ سیناکلون: SL7021)
• پودر آگارز با کیفیت بالا (جهت تهیه ژل ۲ تا ۳ درصد)

آماده‌سازی اولیه

۱. کیت را از فریزر -20 °C خارج کرده و اجازه دهید اجزا روی یخ ذوب (Thaw) شوند.

۲. لوله‌های PCR را بر اساس نمونه‌ها، کنترل مثبت (Positive Control) و کنترل منفی (Negative Control) نشانه‌گذاری کنید.

مراحل آماده‌سازی واکنش (PCR Setup)

کلیه مراحل زیر را روی یخ انجام دهید:

۱. به ازای هر لوله واکنش، مقدار 19.8µL از محلول Master Mix را اضافه کنید (پیش از مصرف مسترمیکس را مختصر مخلوط و اسپین نمایید).

۲. مقدار 0.2µL از آنزیم Taq DNA Polymerase را به هر لوله اضافه کنید.

۳. درب لوله‌ها را بسته و آن‌ها را داخل یک کیسه پلاستیکی زیپ‌کیپ زیپ‌دار قرار داده و محکم ببندید؛ سپس لوله‌ها را به بخش اضافه کردن الگو (Extraction / Template Area) منتقل نمایید.

۴. الگوی دی‌ان‌ای را به ترتیب زیر به لوله‌ها اضافه کنید:

• لوله تست نمونه: مقدار 5µL از دی‌ان‌ای استخراج‌شده نمونه
• لوله کنترل مثبت: مقدار 5µL از Positive DNA Control
• لوله کنترل منفی: مقدار 5µL از آب دیونیزه عاری از نوکلئاز (DNase Free Water)

(حجم نهایی در هر لوله برابر با 25µL خواهد بود).

۵. درب لوله‌ها را ببندید، به مدت ۳ تا ۵ ثانیه در میکروفیوژ اسپین کنید تا قطرات به ته تیوب منتقل شوند.

برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر (Thermal Cycling Program)

لوله‌ها را در دستگاه ترموسایکلر از پیش گرم‌شده قرار داده و برنامه دمایی زیر را فعال نمایید:

• مرحله واسرشت اولیه (First Stage):
  
  • دمای 94 °C به مدت 300 ثانیه (۵ دقیقه) – ۱ چرخه
• مرحله چرخه تکثیر (34 چرخه):
  
  • واسرشت: دمای 94 °C به مدت 30 ثانیه
  • اتصال (Annealing): دمای 60 °C به مدت 30 ثانیه
  • طویل‌سازی: دمای 72 °C به مدت 30 ثانیه
• مرحله طویل‌سازی نهایی (Last Stage):
  
  • دمای 72 °C به مدت 300 ثانیه (۵ دقیقه) – ۱ چرخه
• نگهداری نهایی در دمای 4 °C

(توجه: با توجه به نوع مدل دستگاه ترموسایکلر و سرعت تغییرات دمایی، پارامترهای زمان‌بندی ممکن است نیازمند تطبیق جزئی باشند).

آنالیز و تفسیر نتایج روی ژل

• مقدار 10µL از محصول PCR را مستقیماً و بدون نیاز به افزودن لودینگ بافر روی ژل آگارز ۲ تا ۳ درصد بارگذاری نمایید.
• جهت بررسی و تعیین دقیق سایز باندها، از مارکر مولکولی 50bp DNA Ladder استفاده کنید.
• تفسیر باندها:
  
  • ظهور باندی به طول 115bp نشان‌دهنده نتیجه مثبت تست (وجود ژنوم توکسوپلاسما گوندی) است.
  • در لوله کنترل منفی نباید هیچ‌گونه باندی در محدوده 115bp مشاهده شود.
  • تشکیل باند 115bp در ستون لوله کنترل مثبت الزامی است و تاییدکننده صحت فرآیند تکثیر و سلامت آنزیم است.

جدول راهنمای رفع اشکال

سوالات متداول

۱. چرا از ژن B1 برای شناسایی توکسوپلاسما گوندی در این کیت استفاده شده است؟

ژن B1 شامل کپی‌های متوالی تکرارشونده در سراسر ژنوم این انگل است. هدف‌گیری این بخش باعث می‌شود حتی در حضور حداقل تعداد انگل در بافت یا نمونه خون، سیگنال تکثیر قابل تشخیصی با ایجاد قطعه 115bp به دست آید و حساسیت تست تا سطح ۴۵ کپی حفظ گردد.

۲. برای استخراج DNA از نمونه‌های مدفوع یا خاک چه پروتکلی پیشنهاد می‌شود؟

از آنجا که نمونه‌های مدفوع و خاک حاوی مهارکننده‌های قوی واکنش PCR (مانند اسید هومیک و پلی‌ساکاریدها) هستند، باید حتماً از کیت‌های تجاری استاندارد اختصاصی خاک یا مدفوع جهت استخراج دی‌ان‌ای با درجه خلوص بالا استفاده شود. برای نمونه‌های بافتی و بالینی، کیت‌های SinaPure و DNP سیناکلون کاملاً مناسب هستند.

۳. آیا محصول واکنش پیش از بارگذاری روی ژل به بافر لودینگ نیاز دارد؟

خیر، مسترمیکس این کیت به گونه‌ای بهینه‌سازی شده است که ۱۰ میکرولیتر از محصول نهایی PCR مستقیماً و بدون نیاز به افزودن Loading Buffer قابل بارگذاری روی ژل آگارز ۲ تا ۳ درصد می‌باشد.