کیت تشخیص آلودگی مایکوپلاسما (Mycoplasma )

معرفی و مکانیسم عملکرد

مایکوپلاسماها (Mycoplasmas) ساده‌ترین و کوچک‌ترین میکروارگانیسم‌های پروکاریوتی با توانایی خود‌تکثیری هستند. این باکتری‌ها فاقد دیواره سلولی پپتیدوگلیکانی بوده و اندازه‌ای بین ۰.۲ تا ۰.۸ میکرومتر دارند؛ به همین دلیل، برخلاف سایر باکتری‌ها، به سادگی از فیلترهای استریلیزاسیون عبور کرده و در برابر آنتی‌بیوتیک‌های رایج مهارکننده دیواره سلولی (مانند پنی‌سیلین و مشتقات بتا-لاکتام) کاملاً مقاوم هستند. ورود مایکوپلاسما به محیط‌های کشت سلولی معمولاً بدون ایجاد کدورت ظاهری، تغییر رنگ فنل رد یا تغییر اسیدیته سریع رخ می‌دهد، اما عواقب مخربی نظیر تغییر در متابولیسم سلول، القای ناهنجاری‌های کروموزومی، مهار رشد و تغییر در بیان ژن‌ها و سایتوکاین‌ها به همراه دارد.

کیت تشخیص آلودگی مایکوپلاسما سیناکلون بر پایه تکنیک اختصاصی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای (Nested PCR) طراحی شده است. در این مکانیسم، تکثیر ژنوم در دو مرحله متوالی انجام می‌گیرد:

۱. مرحله اول (Primary Amplification): با استفاده از مسترمیکس PCR Mix I، جفت پرایمرهای خارجی یک ناحیه عمومی و حفاظت‌شده از ژنوم مایکوپلاسما را تکثیر می‌کنند.

۲. مرحله دوم (Secondary Nested Amplification): مقدار اندکی از محصول مرحله اول به عنوان الگو برداشته شده و توسط جفت پرایمرهای داخلی در مسترمیکس PCR Mix II تکثیر می‌گردد.

این سازوکار علاوه بر ارتقای چشمگیر حساسیت تشخیصی برای ردیابی حتی کمترین تیتر آلودگی، ویژگی (Specificity) واکنش را تضمین می‌کند؛ زیرا احتمال اتصال تصادفی دو جفت پرایمر مستقل به ژنوم سلول‌های پستانداران، بافت‌ها یا باکتری‌هایی نظیر E. coli عملاً صفر است. در پایان، محصولات واکنش مرحله دوم با سایزهای مشخص (219bp تا 426bp) بر روی ژل آگارز نمایان می‌شوند.

ویژگی‌ها و مزایای برجسته کیت

• پوشش جامع گونه‌های شایع: ردیابی هم‌زمان ۸ گونه شاخص که عامل بیش از ۹۵ درصد آلودگی‌های کشت سلولی هستند (M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale, M. pirum, M. salivarium و A. laidlawii).
• بافر لیز سلولی اختصاصی: همراه داشتن ۲ میلی‌لیتر بافر لیز آماده، نیاز به خرید کیت‌های گران‌قیمت یا روش‌های زمان‌بر استخراج DNA را مرتفع کرده و آماده‌سازی نمونه را ظرف مدت کوتاهی در هیتربلاک ممکن می‌سازد.
• مسترمیکس‌های آماده مصرف: کلیه اجزای واکنش از جمله آنزیم Taq DNA Polymerase، نوکلئوتیدها (dNTPs)، بافر بهینه و پرایمرها به صورت دو ترکیب پایدار Mix I و Mix II آماده شده‌اند.
• کنترل مثبت استاندارد: وجود ویال Positive Control امکان صحه‌گذاری کامل مراحل تکثیر، سلامت آنزیم و اطمینان از عملکرد الکتروفورز را فراهم می‌آورد.

کاربردهای تشخیصی و صنعتی

• پایش دوره‌ای و کنترل کیفی رده‌های سلولی در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و دانشگاهی.
• خطوط بیوتکنولوژی تولید پروتئین‌های نوترکیب، آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و واکسن‌های زیستی.
• کنترل کیفی بانک‌های سلولی اولیه (Master and Working Cell Banks) پیش از فریز یا فرآیند تولید انبوه.

شرایط نگهداری و انبارداری

• دمای استاندارد نگهداری کلیه اجزای کیت: -20 °C.
• شرایط حمل و نقل: زنجیره سرد بر روی یخ (Wet Ice).
• توصیه مهم نگهداری: جهت جلوگیری از تکرار چرخه‌های انجماد و ذوب (Freeze-Thaw)، پیشنهاد می‌شود پیش از اولین مصرف، محلول‌های PCR Mix I و PCR Mix II را با توجه به نیاز مصرفی در آزمایشگاه به صورت الیکوت (Aliquot) تقسیم کرده و در دمای -20 °C فریز نمایید.

محتویات کیت (سایز ۲۰ تستی)

• بافر لیز (Lysis Buffer): مقدار 2mL (ترکیبات لیزکننده و آنزیم هضم‌کننده)
• مسترمیکس مرحله اول (PCR Mix I): مقدار 290µL (بافر تکثیر، dNTP، آنزیم Taq DNA Polymerase و پرایمرهای مرحله اول)
• مسترمیکس مرحله دوم (PCR Mix II): مقدار 290µL (بافر تکثیر، dNTP، آنزیم Taq DNA Polymerase و پرایمرهای مرحله دوم)
• آب دیونیزه عاری از نوکلئاز: مقدار 3mL
• کنترل مثبت (Positive Control): ویال کنترل مثبت

جدول مشخصات فنی

راهنمای استفاده و پروتکل آزمایشگاهی

تجهیزات و مواد آزمایشگاهی مورد نیاز

• میکروفیوژ دور بالا (با توانایی رسیدن به 13,000RPM)
• هیتربلاک با قابلیت تنظیم در دماهای 60 °C و 95 °C
• دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler)
• تجهیزات ژل الکتروفورز آگارز و ترانس‌ایلومیناتور
• محلول بافر شستشو (PBS 1x)
• مارکر مولکولی 100bp Ladder

نکات پیش از شروع آزمایش

• آماده‌سازی نمونه، آماده‌سازی مواد PCR و تشخیص آن باید در مکان‌های مستقل و مجزا انجام گیرد.
• جهت آماده‌سازی مواد PCR اکیداً از هود لامینار استفاده شود.
• از آلودگی نمونه‌ها به کنترل مثبت کیت جداً خودداری فرمایید.

مرحله اول: تهیه و آماده‌سازی نمونه (لیز سلولی)

۱. جمع‌آوری سلول‌ها:

• سوسپانسیون سلولی: تعداد 10^4 تا 10^5 سلول از محیط کشت بردارید.
• سلول‌های چسبنده: سلول‌ها را توسط سل اسکرپر (Scraper) از سطح فلاسک جدا کرده و به صورت سوسپانسیون درآورید. (توصیه می‌شود از تریپسین یا EDTA استفاده نشود زیرا این مواد باعث از بین رفتن مایکوپلاسما می‌شوند).

۲. سلول‌های سوسپانسیون (10^4 تا 10^5 سلول) را درون یک میکروتیوب تمیز ریخته و در دمای 4 °C در دور 13,000RPM به مدت ۵ دقیقه رسوب دهید.

۳. به آرامی و با دقت سوپرناتانت را دور بریزید. سلول‌ها را ۲ مرتبه با بافر PBS1x شستشو داده و مجدداً رسوب دهید.

۴. بر روی رسوب سلولی، مقدار 100µL بافر لیز اضافه کنید و رسوب را به خوبی در آن حل کرده و ورتکس نمایید.

۵. میکروتیوب حاوی بافر لیز و سلول‌ها را به مدت یک ساعت در دمای 60 °C انکوبه کنید (در این مدت چند بار ویال را وارونه کنید).

۶. سپس نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه در دمای 95 °C انکوبه نمایید.

۷. ضایعات سلولی را در دور 13,000RPM به مدت ۵ دقیقه رسوب دهید و سپس سوپرناتانت شفاف را به آرامی به میکروتیوب تمیز منتقل کنید (نمونه در این مرحله برای PCR آماده است).

مرحله دوم: واکنش مرحله اول (First Round PCR)

۱. مواد مورد نیاز واکنش مرحله اول را بر اساس جدول زیر ترکیب کنید:

۲. مواد موجود در هر میکروتیوب را به آرامی پیپتاژ کنید. درب لوله‌ها را بسته و اسپین کوتاه انجام دهید تا محلول در انتهای تیوب جمع شود.

۳. میکروتیوب‌ها را درون دستگاه ترموسایکلر قرار داده و برنامه دمایی زیر را اجرا کنید:

• مرحله دناتوراسیون اولیه: دمای 94 °C به مدت ۲ دقیقه (1 چرخه)
• چرخه‌های تکثیر (25 چرخه):
  
  • دمای 94 °C به مدت ۴۰ ثانیه
  • دمای 55 °C به مدت ۴۰ ثانیه
  • دمای 72 °C به مدت ۴۰ ثانیه
• طویل‌سازی نهایی: دمای 72 °C به مدت ۱ دقیقه (1 چرخه) و سپس نگهداری در دمای 4 °C

(توجه: پس از اتمام مرحله اول، نیازی به الکتروفورز ژل نیست و محصول مستقیماً به مرحله دوم واکنش منتقل می‌شود).

مرحله سوم: واکنش مرحله دوم (Second Round PCR)

۱. محصول مرحله اول را به عنوان الگو برداشته و اجزا را بر اساس جدول زیر ترکیب کنید:

۲. برنامه دمایی ترموسایکلر برای مرحله دوم، دقیقاً مشابه برنامه دمایی مرحله اول (۲۵ چرخه) اجرا می‌شود.

مرحله چهارم: آنالیز ژل آگارز و تفسیر نتایج

پس از پایان مرحله دوم، مقدار 10µL از محصول PCR را بر روی ژل آگارز ۲ درصد بارگذاری کنید. جهت تعیین سایز باندها، استفاده از 100bp Ladder توصیه می‌شود.

• باند مشاهده‌شده در تست حاوی کنترل مثبت باید در محدوده 290bp باشد.
• در نمونه کنترل منفی نباید هیچ باندی مشاهده شود.
• ظهور هر باندی در نمونه تست در محدوده 219bp تا 426bp نشان‌دهنده آلودگی با مایکوپلاسما است:

راهنمای عیب‌یابی  

جدول عیب‌یابی و رفع اشکال

سوالات متداول

۱. چرا جداسازی سلول‌های چسبنده نباید با تریپسین انجام شود؟

آنزیم تریپسین یا شلاتورهایی مانند EDTA به ساختار و پروتئین‌های سطحی مایکوپلاسما آسیب می‌زنند و می‌توانند باعث حذف یا تخریب باکتری پیش از لیز شوند. به همین جهت، برداشت فیزیکی سلول‌ها با Cell Scraper الزامی است.

۲. چرا در این کیت از استراتژی Nested PCR استفاده شده است؟

در ابتدای بروز آلودگی، غلظت مایکوپلاسما در محیط کشت بسیار پایین است. استفاده از تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای (Nested PCR) حساسیت تشخیصی را تا چندین برابر افزایش داده و اتصالات متقاطع با ژنوم سلول میزبان را کاملاً خنثی می‌کند.

۳. آیا محصول واکنش مرحله اول نیاز به بررسی روی ژل دارد؟

خیر، محصول دور اول بدون نیاز به ژل، مستقیماً به عنوان الگوی واکنش مرحله دوم استفاده می‌شود تا ضمن صرفه‌جویی در زمان، خطر انتشار آلودگی در محیط کار به حداقل برسد.