کیت تشخیص ویروس اپشتین بار (EBV)

معرفی و مکانیسم عملکرد

ویروس اپشتین بار (Epstein-Barr Virus یا EBV) که با نام هرپس‌ویروس انسانی ۴ (HHV-4) نیز شناخته می‌شود، از اعضای خانواده بزرگ هرپس‌ویریده و یکی از شایع‌ترین ویروس‌ها در جوامع انسانی است. این ویروس عامل اصلی بیماری مونونوکلئوز عفونی (Infectious Mononucleosis) بوده و با انواعی از بدخیمی‌ها نظیر لنفوم بورکیت، لنفوم هوچکین، کارسینوم نازوفارنکس و بیماری‌های لنفوپرولیفراتیو پس از پیوند (PTLD) در بیماران مبتلا به سرکوب ایمنی ارتباط مستقیم دارد. با توجه به حضور مادام‌العمر این ویروس به فرم نهفته (Latency) در لنفوسیت‌های B، تشخیص دقیق فاز فعال تکثیر ژنوم ویروس با روش‌های سرولوژی همواره با چالش‌هایی همراه است؛ لذا تکنیک تکثیر آنزیمی PCR به عنوان روش استاندارد طلایی و مستقیم جهت تشخیص قطعی حضور DNA ویروس به کار می‌رود.

کیت تشخیص PCR ویروس اپشتین بار شرکت سیناکلون، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی‌شده بر روی نواحی تکرارشونده ژن BLLF1 (کدکننده گلیکوپروتئین gp350/220 پوشش ویروس) عمل می‌کند. انتخاب این توالی تکراری موجب افزایش چشمگیر حساسیت ردیابی ژنوم ویروس تا سطح ۳۰ کپی شده و ویژگی تشخیصی را به حداکثر می‌رساند. در طی این فرآیند، نمونه تکثیر یافته در دستگاه ترموسایکلر پس از ۳۳ چرخه دمایی، قطعات مشخصی به ابعاد 239 جفت‌باز یا 256 جفت‌باز (239 bp / 256 bp) تولید می‌کند که وجود این باندها نشانه قطعی حضور ژنوم EBV در نمونه مورد آزمایش است.

ویژگی‌ها و مزایای برجسته کیت

• حساسیت و اختصاصیت ایده‌آل: ردیابی دقیق تا ۳۰ کپی ژنوم بدون هیچ‌گونه واکنش متقاطع با سایر اعضای خانواده هرپس‌ویروس‌ها (نظیر CMV یا HSV).
• آنزیم Taq تفکیک‌شده: عرضه آنزیم نوترکیب Taq DNA Polymerase با غلظت 5U/µL به صورت جداگانه جهت افزایش ثبات و ماندگاری عملکرد کیت.
• مسترمیکس آماده مصرف (EBV PCR Mix): شامل غلظت‌های بهینه‌سازی‌شده از بافر 1X، کلرید منیزیم (MgCl2)، مخلوط dNTPs و پرایمرهای اختصاصی.
• کنترل مثبت استاندارد: دارای Positive DNA Control جهت ارزیابی صحت عملکرد آنزیم و درستی شرایط چرخه دمایی.
• سهولت در مرحله الکتروفورز: امکان بارگذاری مستقیم ۱۰ میکرولیتر از محصول واکنش بر روی ژل آگارز بدون نیاز به بافر لودینگ اضافه.

کاربردهای تشخیصی و بالینی

• تشخیص سریع و قطعی عفونت حاد ویروس اپشتین بار در بیماران مشکوک به مونونوکلئوز عفونی.
• پایش وضعیت بیماران پیوندی، افراد مبتلا به ضعف سیستم ایمنی و غربالگری خطر بروز اختلالات لنفوپرولیفراتیو (PTLD).
• ارزیابی نمونه‌های بیوپسی بافتی، مغز استخوان و خون محیطی در پژوهش‌های انکولوژی و بیوتکنولوژی پزشکی.
• پژوهش‌های دانشگاهی و مطالعات اپیدمیولوژی ویروسی در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی.

شرایط نگهداری و انبارداری

• دمای نگهداری استاندارد کلیه اجزای کیت: -20 °C.
• شرایط ارسال و حمل و نقل: زنجیره سرد بر روی یخ مرطوب یا یخ خشک (Wet or Dry Ice).
• به منظور حفظ کیفیت و پایداری آنزیم و پرایمرها، از چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب (Freeze-Thaw) پرهیز شود. توصیه می‌شود کار با معرف‌ها بر روی یخ یا کول‌بلاک انجام شود.

محتویات کیت (بسته‌بندی ۵۰ تستی)

• مسترمیکس اختصاصی (EBV PCR Mix): مقدار 1000µL (حاوی بافر 1X، نمک MgCl2، مخلوط dNTPs و پرایمرهای ژن BLLF1)
• آنزیم پلیمراز نوترکیب (Taq DNA Polymerase 5U/µL): مقدار 10µL
• کنترل مثبت اختصاصی (Positive DNA Control): مقدار 100µL
• آب دیونیزه عاری از نوکلئاز (DNase Free Deionized Water): مقدار 1mL

مشخصات فنی 

راهنمای استفاده و پروتکل آزمایشگاهی

تجهیزات و مواد مورد نیاز جانبی

• کیت استخراج DNA ویروسی (کیت SinaClon Viral Extraction با کد EX6065 یا کیت DNP با کد EX6071)
• دستگاه ترموسایکلر (Thermocycler)
• سانتریفیوژ میکروتیوب (میکروفیوژ)
• سمپلرهای دقیق به همراه سرسمپلرهای فیلتردار عاری از نوکلئاز
• تجهیزات ژل الکتروفورز و سیستم مستندساز ژل (Gel Doc / UV Transilluminator)
• مارکر مولکولی 100bp DNA Ladder (کد کاتالوگ سیناکلون: SL7031)
• پودر آگارز با گرید مولکولی جهت تهیه ژل ۲ درصد

مراحل آماده‌سازی واکنش (PCR Setup)

کلیه مراحل چینش مواد باید روی یخ صورت گیرد:

۱. کیت را از فریزر -20 °C خارج کرده و اجازه دهید روی یخ ذوب (Thaw) شود.

۲. لوله‌های PCR را بر اساس نمونه بیمار (Test)، کنترل مثبت (Positive Control) و کنترل منفی (Negative Control) نام‌گذاری کنید.

۳. مقدار 19.8µL از محلول EBV PCR Mix به هر لوله اضافه نمایید (پیش از مصرف، مسترمیکس را مختصر مخلوط و اسپین کنید).

۴. مقدار 0.2µL از آنزیم Taq DNA Polymerase به هر میکروتیوب اضافه نمایید.

۵. درب لوله‌ها را بسته یا آن‌ها را در راک مناسب قرار داده و درون یک کیسه زیپ‌کیپ بگذارید و به بخش اضافه کردن الگو (Extraction Area) انتقال دهید.

۶. الگوی ژنتیکی را با استفاده از سمپلرهای اختصاصی الگو به صورت زیر اضافه کنید:

• لوله تست: مقدار 5µL از دی‌ان‌ای استخراج‌شده نمونه بیمار
• لوله کنترل مثبت: مقدار 5µL از محلول Positive DNA Control
• لوله کنترل منفی: مقدار 5µL از آب دیونیزه عاری از نوکلئاز (DNase Free Deionized Water)

(حجم نهایی هر واکنش به 25µL می‌رسد).

۷. درب لوله‌ها را محکم بسته، به مدت ۳ تا ۵ ثانیه در میکروفیوژ اسپین کنید تا محلول کاملاً در ته لوله جمع شود. سپس تیوب‌ها را به ترموسایکلر از قبل گرم‌شده انتقال دهید.

برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر (Cycling Parameters)

برنامه حرارتی را به شرح زیر بر روی دستگاه تنظیم و اجرا نمایید:

• مرحله واسرشت اولیه (First Stage):
  
  • دمای 94 °C به مدت 300 ثانیه (۵ دقیقه) – ۱ چرخه
• مرحله چرخه‌های تکثیر (33 چرخه):
  
  • واسرشت: دمای 93 °C به مدت 30 ثانیه
  • اتصال (Annealing): دمای 59 °C به مدت 30 ثانیه
  • طویل‌سازی: دمای 72 °C به مدت 30 ثانیه
• مرحله طویل‌سازی نهایی (Final Stage):
  
  • دمای 72 °C به مدت 300 ثانیه (۵ دقیقه) – ۱ چرخه
• نگهداری نهایی در دمای 4 °C

(توجه: پارامترهای چرخه‌های حرارتی بسته به نوع و مدل ترموسایکلر ممکن است نیازمند تطبیق جزئی باشد).

آنالیز و تفسیر نتایج روی ژل الکتروفورز

• مقدار 10µL از محصول PCR را به صورت مستقیم و بدون نیاز به افزودن بافر بارگذاری (Loading Buffer) روی ژل آگارز ۲ درصد بارگذاری کنید.
• جهت ارزیابی دقیق سایز باندها، از مارکر مولکولی 100bp Ladder سیناکلون استفاده فرمایید.
• تفسیر نتایج:
  
  • تشکیل باند اختصاصی در اندازه 239bp یا 256bp نشان‌دهنده تست مثبت و حضور ژنوم ویروس اپشتین بار در نمونه است.
  • در ستون کنترل منفی نباید هیچ باندی مشاهده شود (نشان‌دهنده عدم وجود آلودگی محیطی).
  • در ستون کنترل مثبت باید باند اختصاصی و شفاف در محدوده یادشده تشکیل گردد که تاییدکننده کارایی صحیح واکنش است.

جدول عیب‌یابی و رفع اشکال

سوالات متداول 

۱. چرا سایز باند مثبت به صورت ۲۳۹ جفت‌باز یا ۲۵۶ جفت‌باز گزارش شده است؟

ژن BLLF1 ویروس اپشتین بار به عنوان یک توالی تکرارشونده و اختصاصی شناخته می‌شود. تفاوت اندک در سویه‌ها یا ساختار تکرارهای این ناحیه می‌تواند به تولید باندهایی با طول 239bp یا 256bp منجر شود که هر دو بیانگر مثبت بودن نمونه از لحاظ حضور DNA ویروس EBV هستند.

۲. آیا افزودن بافر لودینگ پیش از بارگذاری روی ژل الزامی است؟

خیر، مسترمیکس این کیت حاوی ترکیبات چگال‌کننده مناسب بوده و ۱۰ میکرولیتر از محصول واکنش نهایی را می‌توان بدون افزودن هیچ‌گونه لودینگ بافر اضافی، مستقیماً بر روی چاهک‌های ژل آگارز ۲ درصد بارگذاری نمود.

۳. بهترین کیت پیشنهادی جهت استخراج DNA پیش از این تست کدام است؟

برای نمونه‌های سرم، پلاسما و مایعات بیولوژیک استفاده از کیت SinaClon Viral Extraction (کد EX6065) و برای نمونه‌های بافتی استفاده از کیت DNP سیناکلون (کد EX6071) توصیه می‌شود.